Protocole d’extraction de l’ARN sur colonne QIAGEN

MATERIELS ET PRODUITS UTILISES

Kit Rneasy Mini Handbook QIAGEN N°74104

Chloroforme ERBA N°438601

Tubes eppendorff stérils LES REF 89

Fibrotips Dnase free PROLABO

Microfuge I8 centrifuge BECKMAN COULTER

-métamercaptoéthanol SIGMA M-6250

I. Congélation de cellules en Trizol

 Après la trypsination reprendre le culot avec 10ml de PBS

 Centrifuger 5 min 2000rpm

 Enlever le surnagent

Tapoter le culot cellulaire pour le désagréger (augmentation du rendement)

 Ajouter 1 ml de Trizol à 5 à 30 millions de cellules au maximum.

 Homogénéiser à l’aide d’une pipette

 Attendre 15 min avant d’extraire sur colonne sinon congeler les cellules en trizol à –80°C

II. Extraction de l’ARN (Pour 1 ml de trizol)

TRAVAILLER TOUJOURS DANS LA GLACE

LE PORT DES GANTS LATEX EST INDISPENSABLE

II.1 Extraction et fixation de l’ARN

 Décongeler et homogénéiser le mélange cellules-Trizol

 Ajouter 200 µl de chloroforme spécial ARN à 1 ml de Trizol (pour mieux aspirer le chloroforme : pipeter-jeter-repipeter)

 Homogénéiser par agitation vigoureuse à la main pendant 15 sec

 Incuber 3 min à température ambiante

 Centrifuger pendant 15 min à 13000 rpm à 4°C, en ce moment :

 préparer dans un tube Falcon stérile 15 ml :

* 1ml du tampon RLT dilué avec -mercapthoéthanol (RNAse Free).

La dilution se fait sous hôte chimique : 1 ml de tampon RTL pour 10µl de  et la solution est stable 1 mois

* Ajouter 1ml de la solution d’éthanol 70° (Tiroir 1 à –20° C).

 Homogénéiser par pipetage

 Ajouter le surnageant (phase supérieure) sans toucher l’interphase (protéines) dans un tube Falcon stérile 15

 Ajouter 700 µl au maximum du mélange sur une colonne

 Centrifuger 15 sec à 13000 rpm pour fixer l’ARN

 Jeter le liquide qui se trouve dans le tube de collection

 Mettre le reste de l’échantillon si le volume est > 700 µl et recentrifuger.

Protocole d’extraction de l’ARN sur colonne QIAGEN (page 2)

II.2 Lavages de l’ARN

 Ajouter 700 µl du tampon RW1 dans la colonne

 Centrifuger 15 sec à 13000 rpm pour éliminer les impuretés

 Jeter le tube de collection et le liquide qui se trouve dedans.

 Transférer la colonne dans un nouveau tube de collection de 2 ml

 Mettre 500 µl du tampon RPE dilué dans la colonne

(Pour la dillution du RPE, ajouter 44 ml d’éthanol pour 11 ml de RPE)

 Centrifuger 15 sec à 13000 rpm pour laver les cellules

 Jeter le liquide

 Ajouter 500 µl du tampon RPE dilué

 Centrifuger 2 min à 13000 rpm

 Jeter le liquide contenu dans le tube de collection

 Mettre la colonne dans un nouveau tube de 2 ml et centrifuger 1 min à 13000 rpm pour éliminer les résidus du tampon RPE

II.3 Elution de l’ARN

 Transférer la colonne dans un tube Eppendorf stérile sur lequel est marqué le nom de l’échantillon

 Déposer 30 µl de Rnase-free water directement sur la membrane de la colonne

 Centrifuger 1 min à 13000 rpm

 L’ARN est maintenant élué dans le tube Eppendorf

 Doser l’ARN ( Si la quantité d’ARN espérée est > 30 µg, répéter l’élution avec un second volume d’eau)